Astratto

Una polvere essiccata di funghi basidiomiceti, Ganoderma lucidum, è stata utilizzata nell'Asia orientale in terapie per diverse malattie, incluso il cancro. Tuttavia, i meccanismi molecolari coinvolti nelle azioni biologiche del Ganoderma non sono ben compresi. Abbiamo recentemente dimostrato che la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI 3-chinasi) e il fattore nucleare-j B (NF-jB) regolano la motilità delle cellule di cancro al seno umano altamente invasive mediante la secrezione dell'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (uPA). In questo studio, abbiamo studiato l'effetto di G. lucidum su cellule di cancro al seno e prostata altamente invasive. Qui mostriamo che le spore o il corpo fruttifero essiccato di G. lucidum inibiscono i fattori di trascrizione costitutivamente attivi AP-1 e NF-jB nelle cellule tumorali MDA-MB-231 del seno e PC-3 della prostata. Inoltre, l'inibizione da parte del Ganoderma dell'espressione del recettore uPA e del recettore uPA (uPAR), nonché la secrezione di uPA, ha determinato la soppressione della migrazione delle cellule MDA-MB-231 e PC-3. I nostri dati suggeriscono che le spore e il corpo fruttifero non purificato di G. lucidum inibiscono l'invasione delle cellule del cancro al seno e alla prostata mediante un meccanismo comune e potrebbero avere un potenziale uso terapeutico per il trattamento del cancro.

Ó 2002 Elsevier Science (USA). Tutti i diritti riservati.
Parole chiave: Ganoderma lucidum; Cancro; MDA-MB-231; PC-3; Migrazione cellulare; NF-jB; AP-1; uPA; uPAR

I funghi Ganoderma lucidum (Reishi, Mannentake o Lingzhi) sono stati usati per secoli nell'Asia orientale per curare varie malattie umane come epatite, epatopatia, ipertensione, nefrite, bronchite e tumori [1–3]. La sua polvere essiccata era particolarmente popolare come agente chemioterapico contro il cancro nella corte imperiale dell'antica Cina [4]. Alcuni dei triterpeni, come gli acidi ganoderico e lucidico, recentemente isolati dal Ganoderma hanno dimostrato citotossicità contro il sarcoma di topo e le cellule di carcinoma polmonare di topo in vitro [5]. La somministrazione intraperitoneale di polisaccaridi idrosolubili isolati dal Ganoderma ha inibito la crescita dei tumori solidi del sarcoma-180 nei topi [6,7]. Inoltre, anche i polisaccaridi del Ganoderma sono stati potenziati

* Autore corrispondente. Fax: 1-317-962-7468 Indirizzo e-mail: dsliva@clarian.org (D.Sliva).

produzione di citochine, che successivamente hanno soppresso la proliferazione delle linee cellulari leucemiche HL-60 e U937 [8]. L'invasione tumorale e le metastasi sono processi multiformi che coinvolgono l'adesione cellulare, la degradazione proteolitica delle barriere tissutali e la migrazione cellulare [9]. L'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi uPA e il recettore uPA (uPAR) svolgono un ruolo cruciale nelle metastasi del cancro (per la revisione, vedere [10]). uPA è una serina proteasi che scinde la matrice extracellulare ed è anche coinvolta nell'adesione e migrazione cellulare [11]. Pertanto, uPA può stimolare la migrazione cellulare direttamente attraverso la sua attività proteolitica attivando il fattore di crescita trasformante-b (TGF-b) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) [12,13], o in alternativa, uPA priva di attività proteolitica ha stimolato direttamente la migrazione cellulare attraverso l'interazione con uPAR [14,15]. Inoltre, gli anticorpi che impediscono il legame di uPA con uPAR hanno inibito le cellule indotte da uPA

0006-291X / 02 / $ - vedi articolo in anteprima Ó 2002 Elsevier Science (USA). Tutti i diritti riservati. PII: S0006-291X (02) 02496-8

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Coltura cellulare. La linea cellulare di cancro al seno umano MDA-MB-231 e la linea di cellule di cancro alla prostata umano PC-3 sono state ottenute da ATCC (Manassas, VA). MDA-MB-231 è stato mantenuto nel mezzo Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) e le cellule PC-3 sono state mantenute in mezzo F-12 contenente penicillina (50U / ml), streptomicina (50U / ml) e siero bovino fetale al 10% (FBS). Media e integratori provenivano da GIBCO BRL (Grand Island, NY). FBS è stato ottenuto da Hyclone (Logan, UT).

Test di migrazione cellulare. Le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state raccolte e incubate per 4 ore e per 24 ore, rispettivamente, con GS o GFB da Ganoderma, come indicato nel testo. La chemocinesi è stata valutata nelle camere Transwell in DMEM per le cellule MDA-MB-231 o nelle cellule F-12 contenente il 10% di FBS per PC-3, come descritto in precedenza [33]. Dopo il fissaggio e la colorazione, abbiamo contato il numero di cellule in migrazione da almeno quattro campi casuali utilizzando un microscopio a 20 ingrandimenti [33]. I punti dati rappresentano la SD media dei singoli filtri all'interno di un esperimento rappresentativo ripetuto almeno due volte.

Vitalità cellulare. Le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state raccolte e incubate con Ganoderma per 4 e 24 ore, rispettivamente, come descritto per il test di migrazione cellulare. La vitalità cellulare è stata determinata con la colorazione blu del tripano secondo il protocollo standard [34]. I punti dati rappresentano la SD media in un esperimento rappresentativo ripetuto almeno due volte.

Trasfezione del DNA e dosaggio della cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). Entrambe le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state trasfettate con costrutti reporter NF-jB-CAT o AP-1-CAT e vettore di espressione b-galattosidasi pCH110, come descritto in precedenza [31]. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con GS o GFB per altre 24 ore a 37 ° C, come indicato nel testo. I test CAT sono stati eseguiti come descritto [31]. I punti dati rappresentano la SD media di 3-6 esperimenti di trasfezione indipendenti.

Test di spostamento della mobilità elettroforetica su gel (GEMSA). Le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state trattate per 24 ore con GS e GFB e gli estratti nucleari sono stati preparati come descritto in precedenza [35]. Un GEMSA è stato eseguito con AP-1 marcato con 32P e NF-jB secondo il protocollo standard [31]. Le sonde oligonucleotidiche contenenti sequenze di consenso per AP-1 e NF-jB sono state acquistate da Promega (Madison, WI). Le analisi Supershift sono state eseguite con anticorpi anti-NF-jB p50 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).

Espressione della secrezione di IjBa e uPA. Le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state trattate per 24 ore con GS e GFB e sono stati preparati estratti di cellule intere [36]. IjBa (inibitore jBa) e l'espressione di actina sono stati determinati negli estratti (25 lg) mediante analisi Western blot [31]. La secrezione di uPA è stata determinata dopo il trattamento con GS e GFB per 24 ore in DMEM concentrato da cellule MDA-MB-231 o F-12 medio concentrato da cellule PC-3 come descritto [31].

Immunoistochimica. Le cellule MDA-MB-231 e PC-3 sono state seminate e coltivate in un Chamber Slide System (Lab-Tek II, Nalgene Nunc). Dopo 24 ore di trattamento con GS e GFB, le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed essiccate all'aria senza fissazione chimica a temperatura ambiente. I campioni sono stati lavati per 30 min in PBS e incubati per 15 min in una scatola umidificata con 25 ml di anticorpi uPA (Cédarlane, Ontario, Canada) e uPAR (American Diagnostica, Greenwich, CT), rispettivamente. Dopo il lavaggio con PBS (3 10 min), i campioni sono stati incubati per 15 min con 25ll IgG anti-topo coniugato a isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Protos ImmunoRe- search, San Francisco, CA). I campioni sono stati successivamente risciacquati tre volte con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, i vetrini sono stati fatti reagire con ioduro di propidio (50 lg / ml) per 15 min. Infine, i vetrini sono stati lavati tre volte (10 minuti) e applicati con il coprioggetto. L'espressione di uPA e uPAR e la colorazione dei nuclei sono state rilevate mediante epi-illuminazione in un microscopio Leitz DMRB. Le espressioni di uPA e uPAR sono state valutate in modo semiquantitativo per l'intensità dell'immunoreattività

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utilizzando la seguente scala: forte, moderata, debole e molto debole. Le espressioni di uPA e uPAR sono state analizzate statisticamente confrontando il controllo con campioni trattati rispettivamente con GS e GFB. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il metodo Cochran – Mantel – Haenszel v2 [37] con il software statisticoSASversion8.2 (SASInstitute, Cary, NC).

Risultati

Il ganoderma inibisce la migrazione delle cellule tumorali della mammella e della prostata umane altamente invasive

Abbiamo recentemente dimostrato che la migrazione cellulare di cellule di cancro al seno umano altamente invasive e resistenti alla chemioterapia MDA-MB-231 dipende da AP-1 e NF-jB costantemente attivi e dalla secrezione di uPA [31,32]. Poiché gli estratti di Ganoderma sono stati usati per il trattamento del cancro nei paesi asiatici per secoli [4], abbiamo voluto chiarire i meccanismi coinvolti nelle sue attività antitumorali. La morfologia dei campioni di Ganoderma è stata confermata al microscopio (Fig. 1A). Per valutare il ruolo del Ganoderma sulla motilità metastatica delle cellule di cancro al seno umano, abbiamo preincubato le cellule MDA-MB-231 per 1 ora con spore (GS) e corpo fruttifero (GFB) e determinato la motilità cellulare dopo altre 3 ore sotto condizioni standard del test di migrazione cellulare [33]. Come si vede nella Fig. 1B, sia le spore che il corpo fruttifero (0,5-2,5 mg / ml) hanno inibito in modo significativo la motilità cellulare delle cellule di cancro al seno in maniera dose-dipendente.

Per determinare se il Ganoderma inibisce anche la mobilità delle cellule di cancro alla prostata altamente invasive, abbiamo prein-cubato le cellule PC-3 con GS e GFB (0,5-2,5 mg / ml) per 1 ora e determinato la migrazione cellulare dopo ulteriori 23 ore di incubazione (sebbene le cellule di cancro alla prostata PC-3 siano altamente invasive, hanno bisogno di un tempo di incubazione più lungo nei saggi di migrazione rispetto alle cellule di cancro al seno altamente invasive MDA-MB-231). La motilità cellulare della Fig. 1C mostra che sia le spore che il corpo fruttifero hanno inibito in modo significativo la migrazione costitutiva delle cellule PC-3. Pertanto, Ganoderma è stato in grado di sopprimere la migrazione costitutiva delle cellule di cancro al seno altamente invasive MDA-MB-231 e delle cellule di cancro alla prostata altamente invasive PC-3.

Per determinare se l'inibizione della motilità cellulare è causata dall'effetto citotossico del Ganoderma, abbiamo incubato sia cellule MDA-MB-231 che PC-3 con GS e GFB nelle stesse condizioni del test di migrazione cellulare e la vitalità cellulare è stata determinato con macchia blu trypan. Le spore o il corpo fruttifero non hanno dimostrato citotossicità né per le cellule MDA-MB-231 né per le cellule PC-3 alla massima concentrazione utilizzata, 2,5 mg / ml (dati non mostrati).

Il ganoderma sopprime AP-1 e NF-jB costitutivamente attivi nelle cellule di cancro al seno e alla prostata

L'attività costitutiva di legame al DNA di NF-jB è stata segnalata in precedenza nei tumori della mammella primari [22],

e abbiamo recentemente dimostrato che l'inibizione della PI 3-chinasi e della proteina chinasi C (PKC) sopprime la transattivazione costitutiva di NF-jB e AP-1 nelle cellule di cancro al seno altamente invasive MDA-MB-231

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[31,32]. Per esaminare se il Ganoderma può inibire la transattivazione di NF-jB e AP-1, abbiamo transfettato transitoriamente cellule MDA-MB-231 con plasmidi genici reporter NF-jB-CAT o AP-1-CAT e trattato le cellule con spore e corpo fruttifero per 24 h. Come si vede nella Fig. 2A, il trattamento con entrambe le spore e il corpo fruttifero ha inibito l'attivazione costitutiva di NF-jB in maniera dose-dipendente (0,5-2,5 mg / ml). Abbiamo anche osservato lo stesso effetto sull'attivazione costitutiva di AP-1 dove una maggiore concentrazione di spore e corpo fruttifero inibiva AP-1 nelle cellule MDA-MB-231 (Fig. 2B). Poiché abbiamo recentemente dimostrato che l'attività di NF-jB e AP-1 era soppressa solo a livello di transattivazione senza i cambiamenti nell'attività di legame del DNA nelle cellule MDA-MB-231 [31,32], eravamo interessati a vedere se Il ganoderma inibisce l'attività costitutiva di NF-jB e AP-1 con lo stesso meccanismo. Gli estratti nucleari di cellule MDA-MB-231 trattate con spore o corpo fruttifero per 24 ore sono stati sottoposti ad analisi di gel shift con sonde marcate con NF-jB e AP-1; la specificità del legame di NF-jB e AP-1 nelle cellule MDA-MB-231 è stata confermata in precedenza da analisi su gel competitivo e supershift [31,32]. Come si vede in Fig. 2C, pretrattamento di spore e corpo fruttifero a una concentrazione di 2,5 mg / ml

ha ridotto notevolmente l'attività costitutiva di legame al DNA di NF-jB. Tuttavia, l'attività costitutiva di legame al DNA dell'AP-1 non è stata influenzata dal trattamento con Ganoderma (Fig. 2D). Pertanto, la diminuzione dell'attività costitutiva di NF-jB in un saggio del gene reporter da parte del Ganoderma riflette la soppressione del legame del DNA NF-jB, mentre l'attività costitutiva dell'AP-1 è soppressa a livello di transattivazione senza modificare il DNA dell'AP-1- rilegatura.

L'attività costitutiva di NF-jB è stata recentemente segnalata in linee cellulari di tumore prostatico indipendente dagli androgeni [29]. Alla luce di questo risultato, abbiamo voluto esaminare l'effetto del Ganoderma sull'attività di NF-jB e AP-1 nelle cellule di cancro alla prostata altamente invasive PC-3. L'analisi del gel-shift ha confermato l'attività costitutiva di legame del DNA NF-jB negli estratti nucleari da cellule PC-3, la cui specificità è stata determinata da saggi competitivi e supershift con anticorpi anti-NF-jB p50 (Fig. 3A). Inoltre, estratti nucleari da cellule PC-3 hanno dimostrato l'elevata attività costitutiva di legame del DNA di AP-1 (Fig. 3B). Per esaminare se il Ganoderma impiega lo stesso meccanismo di inibizione della migrazione nelle cellule di cancro al seno e alla prostata, abbiamo trasfettato le cellule PC-3 con entrambi i plasmidi del gene reporter NF-jB-CAT e AP-1-CAT

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e ha trattato le cellule con spore e corpo fruttifero per 24 ore come descritto sopra. Come si vede nella Fig. 3C, sia le spore che il corpo fruttifero hanno inibito l'attivazione costitutiva di NF-jB nelle cellule PC-3 in modo dose-dipendente (0,5-2,5 mg / ml). L'attivazione costitutiva di AP-1 è stata inibita anche dal trattamento con spore e corpo fruttifero (Fig. 3D). L'analisi dello spostamento del gel ha dimostrato che il legame al DNA di NF-jB nelle cellule PC-3 è stato ridotto anche dal trattamento con spore e corpo fruttifero del Ganoderma (Fig. 3E). Tuttavia, l'attività di legame al DNA di AP-1 non è stata influenzata dallo stesso trattamento con spore o corpo fruttifero (Fig. 3F). Perciò,

Il ganoderma ha inibito sia il legame al DNA che la transattivazione di NF-jB, mentre l'inibizione di AP-1 si è verificata solo a livello di transattivazione. Possiamo concludere da ciò che lo stesso meccanismo di inibizione è impiegato sia dalle cellule del cancro al seno che alla prostata.

L'inibizione della migrazione e dell'attivazione di NF-jB da parte di Ganoderma è indipendente da IjBa

NF-jB può essere inibito sequestrando nel citoplasma mediante l'assemblaggio con la proteina inibitoria IjBa [38] o mediante il meccanismo alternativo, indipendente

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di IjBa [39]. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che sebbene la sovraespressione di IjBa abbia soppresso la migrazione delle cellule MDA-MB-231, l'inibizione della transattivazione di NF-jB da parte della PI 3-chinasi e degli inibitori PKC era un processo indipendente da IjBa [31,32]. Pertanto, abbiamo studiato se Ganoderma inibisse l'attivazione costitutiva di NF-jB aumentando i livelli di IjBa e sequestrando NF-jB nel citoplasma. Le cellule MDA-MB-231 sono state trattate con spore (0,5-2,5 mg / ml) e corpo fruttifero (0,5-2,5 mg / ml) di Ganoderma per 24 ore e gli estratti di cellule intere sono stati sottoposti a SDS-PAGE. L'analisi Western blot con anticorpo anti-IjBa ha rivelato che il trattamento con spore o corpo fruttifero di Ganoderma non ha aumentato i livelli di IjBa (non mostrato). Come previsto, abbiamo osservato lo stesso comportamento in cellule di cancro alla prostata altamente invasive, dove anche il trattamento con spore o corpo fruttifero di Ganoderma non ha aumentato i livelli di IjBa nelle cellule PC-3 (non mostrato). Complessivamente, questi dati hanno chiaramente dimostrato che il Ganoderma inibisce la migrazione e l'attivazione costitutiva di NF-jB nelle cellule di cancro al seno e alla prostata mediante un distinto meccanismo di segnalazione indipendente da IjBa.

Il ganoderma sopprime la secrezione costitutiva di uPA dalle cellule di cancro al seno e alla prostata

Abbiamo già dimostrato che cellule di cancro al seno altamente invasive secernono costitutivamente uPA e che questa secrezione può essere soppressa dall'inibizione della PI 3-chinasi e PKC [31,32]. Per esaminare l'effetto del Ganoderma sulla secrezione di uPA dalle cellule di cancro al seno, abbiamo trattato cellule MDA-MB-231 con spore (0,5-2,5 mg / ml) e corpo fruttifero (0,5-2,5 mg / ml) di Ganoderma e sono stati sottoposti i terreni concentrati all'analisi Western blot con anticorpo anti-uPA. Come si vede nella Fig. 4A, sia le spore che il corpo fruttifero hanno inibito marcatamente la secrezione di uPA in maniera dose-dipendente. Poiché l'espressione di uPA di solito è correlata al fenotipo aggressivo delle cellule di cancro alla prostata [40], eravamo interessati a sapere se anche le cellule di cancro alla prostata altamente invasive PC-3 secernono uPA e se il Ganoderma inibisce questa secrezione. Le cellule PC-3 sono state trattate e analizzate come descritto sopra per le cellule MDA-MB-231. L'analisi Western blot ha dimostrato che le cellule PC-3 secernono uPA e il trattamento con spore e corpo fruttifero ha chiaramente soppresso la secrezione di uPA dalle cellule PC-3 in modo dose-dipendente (Fig. 4B). Pertanto, il Ganoderma ha inibito la secrezione di uPA dalle cellule tumorali sia mammarie che prostatiche.

Inibizione dell'espressione di uPA e uPAR da parte del Ganoderma nelle cellule di cancro al seno e alla prostata

Come accennato in precedenza, l'espressione di uPA e uPAR è controllata dai fattori di trascrizione AP-1 e NF-jB [24-26], e abbiamo dimostrato che Gano-

derma inibisce sia AP-1 che NF-jB nelle cellule MDA-MB-231 e PC-3. Per esaminare l'effetto del Ganoderma sull'espressione di uPA e uPAR, abbiamo trattato cellule MDA-MB-231 con spore o corpo fruttifero (2,5 mg / ml) per 24 he immunocolorate con anticorpi anti-uPA. Come si vede nella Fig. 5, sia le spore che il corpo fruttifero del Ganoderma hanno ridotto significativamente l'espressione di uPA nelle cellule MDA-MB-231 (Fig. 5A, a – c, Tabella 1). L'immunocolorazione con anticorpi anti-uPAR ha dimostrato che l'espressione di uPAR era ridotta anche nelle cellule MDA-MB-231 trattate sia con spore che con corpo fruttifero (Fig. 5A, d-f, Tabella 1). Analogamente ai risultati ottenuti con le cellule MDA-MB-231, anche l'espressione di uPA e uPAR nelle cellule PC-3 è stata inibita dalle spore e dal corpo fruttifero (Fig. 5B, Tabella 2). Presi insieme, questi dati mostrano che il Ganoderma ha inibito l'espressione di uPA e uPAR in cellule di cancro al seno e alla prostata altamente invasive.

Discussione

Abbiamo recentemente dimostrato che AP-1 e NF-jB controllano la secrezione costitutivamente attiva di uPA e che l'inibizione delle cellule AP-1 e NF-jB soppresse

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Tabella 1
Espressioni di uPA e uPAR nelle cellule MDA-MB-231

Immunocolorazione (%) uPA uPAR ControlN1⁄412GSN1⁄47GFBN1⁄47ControlloN1⁄49GSN1⁄47GFBN1⁄47

Forte 50,0 0 0 55,6 0 0

Moderato Debole Molto debole Valore pa

50.0 0
0 57.1 0 42.9

p <0:01

0 44.4 14.3 0 85.7 0
p <0:01

0 42.9 57.1

p <0:01

0 14.3 85.7

p <0:01

Le espressioni di uPA e uPAR nelle cellule MDA-MB-231 (trattate come descritto nella Fig. 5A) sono state rilevate dall'intensità di uPA e uPAR mediante immunocolorazione. L'intensità della reattività immunoistochimica è stata valutata in modo semiquantitativo come descritto in Materiali e metodi perché più del 95% delle cellule per pozzetto mostrava caratteristiche simili e non è stata identificata alcuna variabilità significativa tra le cellule all'interno dello stesso pozzetto. .

a Ciascun trattamento è stato confrontato separatamente con il controllo utilizzando il test Mantel – Haenszel v2.

motilità e secrezione di uPA di cellule di cancro al seno altamente invasive [31,32]. Nel presente studio, abbiamo esaminato l'effetto del vecchio fungo medicinale asiatico G. lucidum sulle cellule di cancro al seno e alla prostata altamente invasive. Qui mostriamo che sia le spore che il corpo fruttifero

di Ganoderma inibisce l'attivazione costitutiva di AP-1 e NF-jB. Inoltre, il Ganoderma inibisce l'espressione di uPA e uPAR, nonché la secrezione di uPA e la migrazione cellulare delle cellule MDA-MB-231 e PC-3.

610 D. Sliva et al. / Comunicazioni sulla ricerca biochimica e biofisica 298 (2002) 603–612 Tabella 2

Espressioni di uPA e uPAR nelle cellule PC-3
Immunocolorazione (%) uPA uPAR

Controllo N 1⁄4 13 GS N 1⁄4 7 GFB N 1⁄4 10 Controllo N 1⁄4 9 GS N 1⁄4 7 GFB N 1⁄4 7

Forte 69.20077.800

Moderato Debole Molto debole Valore pa

30.8 0
0 57.1 0 42.9

p <0:01

0 22.2 50.0 0 50.0 0
p <0:01

0 71.4 28.6

p <0:01

0 42.9 57.1

p <0:01

Le espressioni di uPA e uPAR nelle cellule PC-3 (trattate come descritto nella Fig. 5B) sono state quantificate e analizzate statisticamente in 7-13 campioni indipendenti come descritto nella Tabella 1.

a Ciascun trattamento è stato confrontato separatamente con il controllo utilizzando il test Mantel – Haenszel v2.

Sebbene il Ganoderma sia stato usato per secoli nella medicina asiatica per trattare e prevenire varie malattie e le sue spore purificate o l'intero corpo fruttifero siano distribuiti come integratori alimentari, gli effetti biologici del Ganoderma rimangono sfuggenti. È stato suggerito che gli effetti antitumorali del Ganoderma fossero causati da triterpeni [5], polisaccaridi [6,7] e proteine immunomodulatrici [41] e dai meccanismi che coinvolgono l'inibizione della modifica post-traduzionale dell'oncoproteina Ras [42] inibizione della DNA polimerasi [4] o stimolazione della produzione di citochine [8]. Recentemente, la via di segnalazione della chinasi chinasi attivata da mitogeno (MAP), attivata da estratti di Ganoderma, è stata identificata nell'induzione del differenziamento neuronale e nella prevenzione dell'apoptosi [43]. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che il Ganoderma ha inibito la motilità cellulare aumentata di cellule cancerose della mammella e della prostata altamente invasive inibendo la segnalazione AP-1 e NF-jB con attività costitutiva. L'inibizione di AP-1 e NF-jB da parte del fungo asiatico Ganoderma è di particolare interesse perché studi recenti suggeriscono che AP-1 e NF-jB sono potenziali bersagli per il trattamento del cancro [44,45]. Inoltre, l'inibizione di NF-jB da parte dell'inibitore del proteasoma PS-341 è considerata negli studi clinici un adiuvante alla chemio terapia sistemica del cancro [46]. Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato spore purificate o l'intero corpo fruttifero di Ganoderma, che sono disponibili come integratori alimentari, e non abbiamo trovato differenze significative nell'attività biologica tra le spore e l'intero corpo fruttifero del Ganoderma. La dose utilizzata, 0,5-2,5 mg / ml di spore o corpo fruttifero di Ganoderma per 1 milione di cellule cancerose, ha inibito notevolmente la migrazione e l'attivazione costitutiva di AP-1 e NF-jB nelle cellule di cancro al seno e alla prostata. La dose raccomandata, sulla base dei dati di studi clinici con altri funghi, dovrebbe essere di 5-10 g di corpo fruttifero al giorno, con un aumento lineare dell'efficacia previsto fino a 30 g / giorno [47].

Qui mostriamo l'inibizione di NF-jB nell'attività di legame del DNA e nei test del gene reporter nelle cellule di cancro al seno e alla prostata. Nei nostri studi precedenti [31,32] abbiamo dimostrato che l'inibizione della PI 3-chinasi e PKC sopprime NF-jB nelle cellule di cancro al seno solo a livello di transattivazione. Pertanto, probabilmente Ganoderma

impiega un meccanismo specifico per l'inibizione di NF-jB indipendente dalle vie PI 3-chinasi e PKC. Anche se la transattivazione costitutiva di AP-1 è stata inibita dal Gonaderma nel test del gene reporter nelle cellule di cancro al seno e alla prostata, l'attività di legame al DNA di AP-1 non è stata modificata. L'inibizione di AP-1 a livello di transattivazione può essere spiegata dai diversi meccanismi di attivazione di NF-jB e AP-1. Poiché è stato dimostrato che NF-jB induce la trascrizione di geni regolati da AP-1 attraverso l'interazione di NF-jB con AP-1 [30], è possibile che Ganoderma inibisca il legame del DNA e la transattivazione di NF-jB, che a sua volta inibisce AP-1 solo a livello di transattivazione senza modificare l'attività di legame al DNA di AP-1.

L'attività di NF-jB è controllata dagli inibitori di NF-jB, IjBs, una famiglia di proteine che si legano ai dimeri di NF-jB, nascondendo la loro sequenza di localizzazione nucleare e determinando ritenzione citoplasmatica di NF-jB [38,48]. Nel presente studio, mostriamo che sebbene Ganoderma inibisca NF-jB, i livelli di jBa non vengono modificati, suggerendo che l'attività di NF-jB è regolata da un percorso distinto che non coinvolge IjB. Recentemente, la via di attivazione di NF-jB, separata dalla degradazione IjB, è stata descritta nelle vie di trasduzione del segnale PI 3-chinasi e Akt-dipendenti [39,49,50]. Inoltre, i nostri dati precedenti dimostrano che l'inibizione della PI 3-chinasi nelle cellule MDA-MB-231 sopprime anche la migrazione cellulare attraverso la via NF-jB indipendentemente dalla degradazione IjBa [31].

Si sono accumulate prove convincenti che dimostrano che uPA e uPAR svolgono un ruolo importante nelle metastasi del cancro. La correlazione tra le concentrazioni di uPA e uPAR e la prognosi sfavorevole è particolarmente in accordo con l'idea che l'uPA legato all'uPAR sulla superficie delle cellule tumorali sia necessario per l'invasione da parte delle cellule tumorali e delle metastasi [10]. Inoltre, abbiamo recentemente riportato che la secrezione di uPA è responsabile della migrazione cellulare di cellule di cancro al seno altamente invasive e della secrezione di uPA mediata da AP-1- e NF-jB [31,32]. Come mostrato sopra, il Ganoderma inibisce AP-1 e NF-jB nelle cellule tumorali sia della mammella che della prostata. Pertanto, abbiamo esaminato l'effetto del Ganoderma sull'espressione e sulla secrezione di uPA da MDA-231 e PC-3

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cellule cancerogene. I nostri dati hanno dimostrato che le spore e il corpo fruttifero di Ganoderma diminuiscono notevolmente

pressione e secrezione di uPA dalle cellule tumorali mammarie e prostata. Inoltre, anche l'espressione del recettore uPA è diminuita dopo il trattamento con Ganoderma. Come accennato in precedenza, sia uPA che uPAR contengono sequenze di legame del DNA AP-1 e NF-jB nelle loro regioni promotore. Pertanto, Ganoderma è in grado di sopprimere l'espressione sia di uPA che di uPAR in cellule di cancro al seno e alla prostata altamente invasive, suggerendo che un meccanismo comune può essere impiegato per inibire le metastasi del cancro.

Negli ultimi anni, l'uso di terapie a base di erbe nella medicina alternativa è aumentato e, sebbene il numero di malati di cancro che utilizzano integratori alimentari a base di erbe non sia esattamente noto, ci sono prove del crescente uso di integratori alimentari nel trattamento del cancro [51] . Il Ganoderma lucidum è una delle erbe nella miscela di erbe PC-SPES, che ha mostrato attività contro la malattia refrattaria agli ormoni in due pazienti con cancro alla prostata [52]. Estratti di PC-SPES hanno dimostrato effetti estrogenici [53] e una diminuzione della crescita di cellule tumorali della prostata sensibili agli ormoni e insensibili agli ormoni [54]. I nostri dati dimostrano chiaramente che il Ganoderma ha inibito i fattori di trascrizione AP-1 e NF-jB, seguito dalla soppressione dell'espressione di uPA e uPAR, con conseguente inibizione della mobilità cellulare di cellule cancerose della mammella e della prostata altamente invasive. Questi dati suggeriscono l'attività biologica antitumorale del Ganoderma nella miscela di erbe PC – SPES. Sebbene diversi composti biologicamente attivi isolati dal Ganoderma dimostrino attività antitumorali [5–8], qui mostriamo che l'intero corpo fruttifero non frazionato o le spore di G. lucidum possono sopprimere la migrazione delle cellule tumorali inibendo una specifica via di segnalazione. Saranno necessari ulteriori studi per isolare i componenti più attivi dal Ganoderma e per identificare il loro rapporto ottimale con la più alta attività inibitoria contro le cellule tumorali.

In sintesi, i nostri dati dimostrano che G. lucidumin ha inibito la motilità cellulare di cellule cancerose al seno e alla prostata altamente invasive sopprimendo uPA e uPAR. Pertanto, il Ganoderma sotto forma di integratore alimentare può essere considerato come un ulteriore intervento terapeutico per l'inibizione delle metastasi di tumori mammari e prostatici altamente invasivi.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dott.ssa Karen Spear per la modifica del manoscritto, Ed Brizendine per l'analisi statistica, e Denise Lyons e Tatiana Valachovicova per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Methodist Cancer Center a D.S. e F.P.L., American Heart Association Grant 0051661Z a C.L. e sovvenzioni da Showalter Foundation a C.L. e D.S.

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